動物源性食品中氯霉素類藥物

　　殘留量測定

　　1范圍

　　本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了動物源性食品中氯霉素類殘留量的氣相色譜-質(zhì)譜和液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜測定 方法。

　　本標(biāo)準(zhǔn)適用于水產(chǎn)品、畜禽產(chǎn)品和畜禽副產(chǎn)品中氯霉素、氟甲砜霉素和甲砜霉素殘留的定性確證和 定量測定。

　　2氣相色譜-質(zhì)譜法

　　2. 1原理

　　樣品用乙酸乙酯提取,4%氯化鈉溶液和正己烷液-液分配凈化，再經(jīng)弗羅里硅土(Florisil)柱凈化 后，以甲苯為反應(yīng)介質(zhì)，用N，0雙(三甲基硅基)三氟乙酰胺-三甲基氯硅烷(BSTFA + TMCS，" + 1) 于70 X：硅烷化，用氣相色譜/負(fù)化學(xué)電離源質(zhì)譜測定，內(nèi)標(biāo)工作曲線法定量。

　　2.2試劑和材料

　　除非另有說明，在分析中僅使用確認(rèn)為分析純的試劑和二次去離子水或相當(dāng)純度的水。

　　2.2.1甲醇：色譜純。

　　2.2.2甲苯:農(nóng)殘級。

　　2.2.3正己烷:農(nóng)殘級。

　　2.2.4乙酸乙酯。

　　2.2.5 乙醚。

　　2.2.6氯化鈉。

　　2. 2. 7氣霉素(CAP)、氟甲砜霉素(FF)、甲砜霉素(TAP)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì):純度>99%。

　　2. 2. 8間硝基氯霉素(m-CAP)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì):純度>99%。

　　2. 2. 9氯化鈉溶液(4%):稱取適量氣化鈉用水配置成4%的氣化鈉溶液，常溫保存，可使用1周。

　　2.2. 10氯霉素類標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：準(zhǔn)確稱取適量氯霉素、氟甲砜霉素和甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(精確到 0.1 mg)，以甲醇配制成濃度為1〇〇 Pg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。

　　2.2.11間硝基氯霉素內(nèi)標(biāo)工作溶液:準(zhǔn)確稱取適量間硝基氯霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(精確到〇• 1 mg)，用甲醇 配制成1〇 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

　　2.2. 12氯霉素類基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:選擇不含氯霉素類的樣品六份，分別添加1 mL內(nèi)標(biāo)工作溶液 (2.2. 11),用這六份提取液分別配成氯霉素、氟甲砜霉素和甲砜霉素濃度為0-1 ng/mL、0.2 ng/mL、 1 ng/mL、2 ng/mL、4 ng/mL、8 ng/mL的溶液,按本方法提取(2. 4.1)、凈化(2. 4. 2)，制成樣品提取液， 用氮?dú)饩徛蹈桑柰榛?2. 4. 3)后，制成標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

　　2.2. 13衍生化試劑：N，0雙(三甲基硅基)三氟乙酰胺-三甲基氯硅燒(BSTFA+TMCS，99+1)。 2.2.14固相萃取柱：弗羅里硅土柱(6.〇 mL，1.0 g)。

　　2.3儀器和設(shè)備

　　2.3. 1氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀:配有化學(xué)電離源(CI)。

　　2.3.2組織搗碎機(jī)。

　　2.3.3固相萃取裝置。

　　2.3.4振蕩器。

　　2.3.5旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

　　2.3.6渦旋混合器。

　　2.3.7離心機(jī)。

　　2.3.8恒溫箱。

　　2.4測定步驟

　　2.4. 1提取

　　稱取10 g(精確到0. 01 g)粉碎的組織樣品于50 mL具塞離心管中，加人1. 〇 mL內(nèi)標(biāo)溶液 (2. 2. 11)和30 mL乙酸乙酯，振蕩30 min，于4 000 r/min離心2 min，上層清液轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，殘 渣用30 mL乙酸乙酯再提取一次，合并提取液,35 °C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至1 mL?2 mL，待凈化。

　　2.4.2 凈化

　　2.4.2. 1液-液萃取

　　提取液濃縮物(2.4. 1)加1 mL甲醇溶解，用20 mL氯化鈉溶液(2. 2. 9)和20 mL正己烷液-液萃 取，棄去正己烷層，水相用40 mL乙酸乙酯分兩次萃取，合并乙酸乙酯相于心形瓶中，35 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至 近干，用氮?dú)饩徛蹈伞?/span>

　　2. 4. 2. 2弗羅里硅土柱凈化

　　弗羅里硅土柱依次用5 mL甲醇、5 mL甲醇-乙醚(3 + 7)溶液和5 mL乙醚淋洗備用。將殘渣 (2.4.2.1)用5.0 mL乙醚溶解上樣，用5.0 mL乙醚淋洗Florisil柱，5.0 mL甲醇-乙醚溶液(3 + 7)洗 脫，洗脫液用氮?dú)饩徛蹈桑柰榛?/span>

　　2.4.3硅烷化

　　凈化后的試樣(2. 4. 2. 2)用0. 2 mL甲苯溶解，加入〇• 1 mL硅烷化試劑(2. 2. 13)混合，于70 X：衍

　　生化60 min。氮?dú)饩徛蹈桑?.0 mL正己烷定容，待測定。

　　2.4.4測定

　　2.4.4.1氣相色譜-質(zhì)譜條件

　　a) 色譜柱:DB-5MS毛細(xì)管柱，30 mX0.25 mm (內(nèi)徑)X0.25 /rni，或與之相當(dāng)者;

　　b) 色譜柱溫度:50 t;保持1 min，25 t：/min升至280 保持5 min;

　　c) 進(jìn)樣口溫度：250 t;

　　d) 進(jìn)樣方式:不分流進(jìn)樣，不分流時間〇. 75 min;

　　e) 載氣:高純氮?dú)猓兌?gt;99. 999%;

　　f) 流速：1. 0 mL/min;

　　g) 進(jìn)樣量:l.〇nL;

　　h) 接口溫度JSOt：;

　　i) 離子源:化學(xué)電離源負(fù)離子模式NCI;

　　j) 掃描方式:選擇離子監(jiān)測;

　　k) 離子源溫度：15〇X：;

　　l) 四級桿溫度：106X：;

　　m) 反應(yīng)氣：甲烷，純度>99. 999%;

　　n) 選擇監(jiān)測離子參見表1。

　2. 4. 4. 2定性測定

　　進(jìn)行試樣測定時，如果檢出色譜峰的保留時間與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)相一致，并且在扣除背景后的樣品質(zhì)譜圖 中，所選擇的離子均出現(xiàn)，而且所選擇離子的相對離子豐度比與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)一致，相對豐度允許偏差不超過表1規(guī)定的范圍，則可判斷樣品中存在對應(yīng)的三種氯霉素。如果不能確證，應(yīng)重新進(jìn)樣，以掃描方式 (有足夠靈敏度)或采用增加其他確證離子的方式來確證。

　　2. 4. 4. 3內(nèi)標(biāo)工作曲線

　　用配制的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(2. 2.12)按2.4.4. 1的氣相色譜-質(zhì)譜條件分別進(jìn)樣，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度 為橫坐標(biāo)，待測組分與內(nèi)標(biāo)物的峰面積之比為縱坐標(biāo)繪制內(nèi)標(biāo)工作曲線。

　　2. 4. 4. 4 定置

　　以mM66(m-CAP和CAP)、339(FF)和409(TAP)為定量離子，樣品溶液中氯霉素類衍生物的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器測定的線性范圍內(nèi)。在上述色譜條件下(2. 4. 4. 1)，m-CAP、CAP、FF、TAP標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 衍生物參考保留時間約為11. 4 min、ll. 8 min、12. 6 min、13. 6 min。氯霉素類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)衍生物總離子 流圖和質(zhì)譜圖參見附錄A中的圖A. 1和圖A. 2。

　　2.4.5平行實(shí)驗

　　按以上步驟，對同一試樣進(jìn)行平行試驗測定。

　　2.4.6空白實(shí)驗

　　除不加試樣外，均按上述測定步驟進(jìn)行。

　　2.5結(jié)果計算

　　結(jié)果按式(1)計算：

　　X = .................. ( 1 )

　　式中：

　　X——試樣中被測組分殘留量，單位為微克每千克(Mg/kg); c——從內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上得到的被測組分濃度，單位為納克每毫升(ng/mL);

　　V——試樣溶液定容體積，單位為毫升(mL); m——試樣的質(zhì)量，單位為克(g)。

　　GB/T 22338—2008 2.6測定低限

　　氣相色譜-質(zhì)譜測定低限為:氯霉素0.1 yg/kg，氟甲砜霉素和甲砜霉素〇.5 Mg/kg。

　　2.7回收率和精密度

　　參見附錄B。

　　3液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法 3. 1原理

　　針對不同動物源性食品中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素殘留，分別采用乙腈、乙酸乙酯-乙醚或乙 酸乙酯提取，提取液用固相萃取柱進(jìn)行凈化，液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀測定，氯霉素采用內(nèi)標(biāo)法定量，甲砜霉素和氟甲砜霉素采用外標(biāo)法定量。

　　3.2試劑和材料

　　除非另有說明，在分析中僅使用確認(rèn)為分析純的試劑和二次去離子水或相當(dāng)純度的水。

　　3.2. 1甲醇:液相色譜級。

　　3.2.2乙腈:液相色譜級。

　　3.2.3丙酮:液相色譜級。

　　3.2.4正丙醇:液相色譜級。

　　3.2.5正己烷:液相色譜級。

　　3.2.6乙酸乙酯:液相色譜級。

　　3.2.7乙醚。

　　3.2.8乙酸鈉。

　　3.2.9乙酸銨。

　　3.2. 10斤葡萄糖醛酸苷酶:約40 000活性單位。

　　3_2. 11乙腈飽和正己院：取200 mL正己院(3. 2.5)于250 mL分液漏斗中，加入少量乙腈(3.2.2),劇烈振搖，靜置分層后，棄去下層乙腈層即得。

　　3.2. 12丙酮-正己烷(1 + 9):丙酮(3. 2. 3)、正己烷(3. 2.5)按體積比1 : 9混勻。

　　3. 2. 13丙酮-正己烷(6+4):丙酮(3. 2. 3)、正己烷(3. 2. 5)按體積比6 : 4混勻。

　　3.2. 14乙酸乙酯-乙醚(75+25):75 1111^乙酸乙酯(3.2.6)與25 1111^乙醚(3.2.7)溶液混勻。

　　3.2. 15乙酸鈉緩沖液(0_ 1 mol/L):稱取乙酸鈉(3. 2. 8)13. 6 g于1 000 mL容量瓶中，加入980 mL

　　水溶解并混勻，用乙酸調(diào)pH到5.0,定容至刻度混勻。

　　3.2. 16乙酸銨溶液(10 mmol/L):稱取乙酸銨(3. 2. 9)0. 77 g于1 000 mL容量瓶中，用水定容至刻度混勻。

　　3.2. 17氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì):純度>99.0%。

　　3.2. 18氯霉素氘代內(nèi)標(biāo)(氯霉素-D5)物質(zhì):純度>99. 9%。

　　3.2. 19標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:分別準(zhǔn)確稱取適量的氯霉素、甲諷霉素和氟甲諷霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(3. 2. 17)(精確 到0.1 mg),用乙腈配成5〇0 fig/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液(4 °C避光保存可使用6個月)。

　　3.2.20氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)中間溶液:分別準(zhǔn)確移取適量的氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液(3.2.19)，用乙腈稀釋成50 fxg/mL的氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)中間溶液(4 X：避光保存可使用3個月)。

　　3.2.21氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:分別準(zhǔn)確移取適量的氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)中間溶液(3. 2. 20)，用流動相稀釋成合適的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(現(xiàn)用現(xiàn)配)。

　　3.2.22氯霉素氘代內(nèi)標(biāo)(氯霉素-D5)儲備溶液:準(zhǔn)確稱取適量的氯霉素-d5標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(3. 2.18)(精確到0• 1 mg)，用乙腈配成100 fzg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液(4 ^避光保存可使用12個月)。

　　3.2.23氯霉素氘代內(nèi)標(biāo)(氯霉素-D5)中間溶液:準(zhǔn)確移取適量的氯霉素-d5儲備溶液(3. 2. 22)，用乙

　　4

　　腈配成1 Mg/mL內(nèi)標(biāo)中間溶液(4 °C避光保存可使用6個月)。

　　3.2.24氯霉素氘代內(nèi)標(biāo)(氯霉素-D5)工作溶液：準(zhǔn)確移取適量的氯霉素-D5中間溶液(3. 2. 23)，用乙 腈配成〇• 1 Hg/mL內(nèi)標(biāo)工作溶液(4 °C避光保存可使用2周)。

　　3.2.25 LC-Si固相萃取柱或相當(dāng)者:200 mg，3mL。

　　3.2.26 EN固相萃取柱或相當(dāng)者:200 mg，3mL。

　　3.2.27 —次性注射式濾器:配有0.45 微孔濾膜。

　　3.3儀器和設(shè)備

　　3.3.1液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀:配有電噴霧離子源。

　　3.3.2高速組織搗碎機(jī)。

　　3.3.3均質(zhì)器。

　　3.3.4旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

　　3.3.5分析天平。

　　3.3.6 移液槍:20〇ML、lmLD 3.3.7心形瓶:100mL，棕色。

　　3.3.8分液漏斗：200 mL。

　　3.3.9聚四氟乙烯離心管：50mL。

　　3. 3. 10離心機(jī)。

　　3.3.11渦旋混合器。

　　3.3.12固相萃取裝置。

　　3.4試樣制備與保存 3.4.1試樣的制備

　　從原始樣品中取出部分有代表性樣品，經(jīng)高速組織搗碎機(jī)均勻搗碎或混勻，用四分法縮分出適量試樣，均分成兩份，裝入清潔容器內(nèi)，加封后作出標(biāo)記，一份作為試樣，一份作為留樣。

　　3.4.2試樣的保存

　　試樣應(yīng)在一20 t條件下保存。

　　3.5測定步驟

　　3.5. 1提取

　　3.5. 1. 1動物組織(肝、腎除外)與水產(chǎn)品

　　稱取試樣5 g(精確至0.01 g),置于50 mL離心管中，加入100 氯霉素氘代內(nèi)標(biāo)(氯霉素-05)工

　　作溶液(3.2. 24)和30 mL乙腈，勻漿，離心5 min。將上清液移人250 mL分液漏斗中，加15 mL乙腈 飽和的正己烷(3. 2. 11)，振蕩5 min，靜置分層，轉(zhuǎn)移乙腈層至100 mL棕色心形瓶中。殘渣中再加入 30 mL乙腈，振搖3 min,離心5 min，取上清液轉(zhuǎn)移至同一分液漏斗，振蕩5 min,靜置分層，轉(zhuǎn)移乙腈層至同一棕色心形瓶中。向心形瓶中加入5 mL正丙醇，于40 °C水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)近干，用氮?dú)獯蹈桑?5 mL丙酮-正己烷(3. 2.12)溶解殘渣。

　　3.5. 1.2動物肝、腎組織

　　稱取試樣5 g(精確至0.01 g)，置于50 mL離心管中，加人30 mL乙酸鈉緩沖液(3. 2. 15)，均質(zhì) 2 min，加人300吣泠葡萄糖醛酸苷酶(3. 2. 10)，于37 °C溫育過夜。消解樣品中加人100 氯霉素氘

　　代內(nèi)標(biāo)(氯霉素-D5)工作溶液(3. 2. 24) ,20 mL乙酸乙酯-乙醚(3. 2. 14),振搖2 min,離心5 min。取上 層有機(jī)層人心形瓶中，在40 C水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)近干，用氮?dú)獯蹈桑? mL丙酮-正己烷(3. 2. 12)溶解 殘渣。

　　3.5. 1.3 蜂蜜

　　稱取蜂蜜試樣5 g(精確至0.01 g)，置于50 mL離心管中，加入100 /^氯霉素氘代內(nèi)標(biāo)(氯霉素- D5)工作溶液(3. 2.24)，5 mL水，混勻，再加人20 mL乙酸乙酯，振搖2 min,離心5 min，移取有機(jī)層到

　　100 mL棕色心形瓶中，于離心管中再加人20 mL乙酸乙酯，振搖2 min,離心5 min,合并有機(jī)層于棕色心形瓶中，40 C水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干,3 mL水溶解殘渣,混勻。

　　3.5.2凈化

　　3.5.2. 1動物組織與水產(chǎn)品

　　用5 mL丙酮-正己烷(3. 2.12)淋洗LC-Si硅膠小柱，棄去淋洗液，將殘渣溶解溶液(3_ 5.1.1、3_ 5.1. 2) 轉(zhuǎn)移到固相萃取小柱上，棄去流出液，用5 mL丙酮-正己烷(3. 2.13)洗脫，收集洗脫液于心形瓶中，4〇 ^水 浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，氮?dú)獯蹈桑? mL水定容，定容液過〇• 45 /xm濾膜(3. 2. 27)至進(jìn)樣瓶，待測定。

　　3. 5. 2. 2 蜂蜜

　　分別用5 mL甲醇，5 mL水活化EN固相萃取柱，將提取液(3. 5. 1.3)轉(zhuǎn)移上柱，用5 mL水淋滌， 用玻璃棒壓干1 min,用3 mL乙酸乙酯洗脫，洗脫液用氮?dú)獯蹈桑? mL水定容，定容液通過0.45 fim 濾膜(3. 2. 27)至進(jìn)樣瓶，待測定。

　　3.5.3液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜測定

　　3.5.3. 1液相色譜條件

　　a) 色譜柱：Zorbax SfrC18, 5/xm，2.1 mmXl50 mm，或與之相當(dāng)者;

　　b) 流動相:水-乙腈-10 mmol/L乙酸銨溶液，梯度洗脫程序參見表2;

3. 5. 3. 2質(zhì)譜/質(zhì)譜條件 參見附錄C。

　　3. 5. 3. 3定性測定

　　按照上述條件測定樣品和建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，如果樣品中化合物質(zhì)量色譜峰的保留時間與標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時間相比在允許偏差士2. 5%之內(nèi);待測化合物定性離子對的重構(gòu)離子色譜峰的信噪比大于或 等于3(S/N>3)，定量離子對的重構(gòu)離子色譜峰的信噪比大于或等于l〇(S/N>10);定性離子對的相對豐度與濃度相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)溶液相比，相對豐度偏差不超過表3的規(guī)定，則可判斷樣品中存在相應(yīng)的目標(biāo) 化合物。氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(MRM) 總離子流圖和重構(gòu)離子色譜圖以及各目標(biāo)化合物相對保留時間參見附錄D中圖D. 1?圖D. 5和 表 D.1。

　　表3定性時相對離子豐度的最大允許偏差

3. 5. 3. 4定量測定

　　氯霉素使用內(nèi)標(biāo)法定量;甲砜霉素和氟甲砜霉素使用外標(biāo)法定量。

　　3.6結(jié)果計算

　　試樣中目標(biāo)化合物殘留量使用儀器數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)或氯霉素殘留量按式(2)計算，甲砜霉素和氟甲砜

　　霉素按式(3)計算:

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