克倫特羅，為強效選擇性β受體激動劑，有強而持久的松弛支氣管平滑肌的作用，用于治療哮喘?？藗愄亓_可促進動物生長，改善動物體內脂肪分配，并增加瘦肉率，20世紀90年代，我國錯誤地將其 作為科研成果開始以飼料添加劑引入并推廣，被俗稱為“瘦肉精”。一連串因食用含克倫特羅的食物而引起的中毒事件發生后，使克倫特羅成了世界上普遍禁用的飼料添加劑1997年以來，我國有關行政 部門多次明令禁止畜牧行業生產、銷售和使用鹽酸克倫特羅。但我國各地克倫特羅中毒事件仍然頻繁 發生，說明非法使用克倫特羅現象依然亨在。為了對畜禽產品中的克倫特羅開展監測，加強市場監督檢驗力度，預防中毒事件的發生，必須建立效的檢測方法。

　　我國在這方面的檢測工作起步較晚,伴隨著國際和國內對克倫特羅的禁用和監控要求，迫切需要發 展適合我國國情的從篩選到確證的一套檢測方法。為此，本標準提出了從酶聯免疫法(ELISA)篩選、髙 效液相色譜法(HPLC)定量到氣質聯機法(GC-MS)確證和定E：這一袞方法來滿足我國動物性食品中克倫特羅殘留監控的需要.

　　第一法氣相色譜-質譜法(GC-MS)

　　2原理

　　固體試樣剪碎，用高氣酸溶液勻漿。液體試樣加人高氯酸溶液，迸行超聲加熱提取，用異丙醇+乙 酸乙酯(40 + 60)萃取，冇機相濃縮，經弱陽離子交換柱進行分離，用乙醉+濃氨水(98 + 2)溶液洗脫，洗 脫液濃縮，經N，0雙三甲基硅烷三氟乙酰胺(BSTFA)衍生后于氣質聯用儀上進行測定。以美托洛爾 為內標，定量。

　　3試劑

　　3-1 克倫特羅(clenbuterol hydrochloride)，純度>99* 5%。

　　3.2 美托洛爾(metoprolol)，純度>99%。

　　3.3磷酸二氫鈉。

       3.4氫氧化鈉。

　　3.5氯化鈉。

　　3.6高氯酸。

　　3.7濃氨水。

　　3.8異丙醇。

　　3.9 乙酸乙酯，

　　3, 10 甲醇：HPLC 級。

　　3.11甲苯：色譜純。

　　3.12乙醇。

　　3, 13衍生劑：N,0-雙三甲基硅烷三氟乙酰胺(BSTFA)。

　　3. 14高氣酸溶液(0.1 mol/U。

　　3. 15氣氧化鈉溶液(1 mol/L)。

　　3. 16 磷酸二氫鈉緩沖液(0.1mol/L，pH = 6.0)。

　　3. 17異丙醇+乙酸乙酯(40 + 60)。

　　3. 18 乙醇+濃氨水(98+2)。

　　3. 19美托洛爾內標標準溶液:準確稱取美托洛爾標準品，用甲醉溶解配成濃度為240 mg/L的內標儲 備液，貯于冰箱中，使用時用甲醇稀釋成2.4 mg/L的內標使用液0

　　3.20克倫特羅標準溶液:準確稱取克倫特羅標準品，用甲醇溶解配成濃度為250 mg/L的標準儲備 液，貯于冰箱中，使用時用甲醇稀釋成0.5 mg/L的克倫特羅標準使用液。

　　3.21弱陽離子交換柱(LC-WCX）（3 mL)。

　　3.22針筒式微孔過濾膜(0.45 μm，水相)。

　　4儀器

　　4.1 氣相色譜-質譜聯用儀(GC/MS）

　　4.2 磨口玻璃離心管:11. 5 cm(長)X3. 5 cm(內徑)，具塞。

　　4.3 5 ml玻璃離心管.

　　4.4 超聲波清洗器a

　　4.5  酸度計。

　　4.6  離心機。

　　4.7  振蕩器。

　　4. 8  旋轉蒸發器。

　　4.9   渦漩式混合器。

　　4. 10   恒溫加熱器。

　　4.11 N2-蒸發器。

　　4. 12勻漿器4 

      5分析步驟

　　5. 1提取

　　5.1.1肌肉、肝臟、腎臟試樣

　　稱取肌肉、肝臟或賢臟試樣10 g(粘確到0.01 g)，用20 mL 0. 1 mol/I.高氣酸溶液勻漿，;^于磨口 玻璃離心管中〖然后晉于超聲波淸洗器中超聲20 min,取出置于80°C水浴中加熱30 min。取出冷卻后 離心(4 500 r/min) 15 min。傾出上済液,沉淀用5 mL 0■ 1 m〇l/L高氣酸溶液洗絡，再離心，將兩次的 上潔液合并。用〗mol/L氫氧化鈉溶液調pH值至9. 5士0. 1,若冇沉淀產生，洱離心(4 500 r/min) 10 min,將上清液轉移至磨口玻璃離心管中，加人8 g氣化鈉，混勻，加入25 mL異丙醇+乙酸乙酯 (40 + 60)，置于振蕩器上振蕩提取20 min。提取完畢，放置5 min(若冇乳化層稍離心一下)。用吸竚小 心將上層有機相移至旋轉蒸發瓶中，用20 mL異丙醉+乙酸乙酯(40 + 60)再E犮萃取一次，合并冇機 相，于60C在旋轉蒸發器上濃縮至近干。用1 mL 0. 1 mol/L磷酸二氫鈉緩沖液(PH6. 0)充分溶解殘 留物，經針筒式微孔過濾膜過濾，洗滌三次后完全轉移至5 mL玻璃離心管中，并用0, 1 mol/L磷酸二 氫鈉緩沖液(pH6, 0)定容至刻度。

　　5. 1.2尿液試樣

　　用移液管跫取屎液5 mL，加人20 mL 0. 1 mol/L高氯酸溶液，超聲20 min混勻。置于80°C水浴中 加熱30 min。以下按5, 1. 1從“用1 mol/L氫氧化鈉溶液調pH似至9. 5±0, 1”起開始操作。

　　5. 1.3血液試樣

　　將血液于4 500 r/min離心，用移液管量取上層血淸1 mLS于5 mL玻璃離心管中，加入2 mL 0.1 mol/L高氯酸溶液，混勻，置于超聲波淸洗器中超聲20 min，取出界于80°C水浴中加熱30 min。取出冷 卻后離心(4： 500 r/min)15 min。傾出上淸液，沉淀用1 mLO. 1 mol/LJfJ氣酸溶液洗從，離心(4 500 r/min) 10 min，合并上清液，再重復一遍洗滌步驟,合并上濟液。向上淸液中加人約1 g氣化鈉，加人2 ml.舁丙醉 +乙酸乙酯(40+60),在渦漩式混合器上振蕩萃取5 min，放置5 min(若冇乳化層稍離心一下)，小心移出 有機相于5 mL玻璃離心管中，按以上萃取步驟重復萃取兩次，合并冇機相。將冇機相在N2-濃縮器上吹 干。用1 mL (XI mol/L磷酸二氫鈉緩沖液(pH6.0)充分溶解殘留物，經簡式微孔過濾膜過濾完全轉移至 5 mL玻璃離心管中，并用0.1 mol/L磷酸二氫鈉緩沖液(pH6.0)定容至刻度。

　　5.2凈化

　　依次用10mL乙醇、3 mL水、3mL0. 1 mo丨/L磷酸二氫鈉緩沖液(pH6.0)，3 mL水沖洗弱PT1離子 交換柱,取適量5. L 1、5. 1.2和5*1. 3的提取液至弱陽離子交換柱上，棄去流出液，分別用4 mL水和

　　4 mL乙醇沖洗柱子，棄去流出液，用6 mL乙醇+濃氨水(98 + 2)沖洗柱子，收集流出液。將流出液在 N2-蒸發器上濃縮至干。

　　5_3衍生化

　　于凈化、吹干的試樣殘渣中加人100 ML?500 中醉，50 yL 2. 4 mg/L的內標工作液，在N2-蒸發

　　器上濃縮至干，迅速加人4〇mL衍生劑(BSTFA),蓋緊塞子，在渦漩式混合器上混勻1 mirug于75T：的 恒溫加熱器中衍生90 min。衍生反應完成后取出冷卻至室溫，在渦漩式混合器上混勻30 3,罝于N2-蒸發器上濃縮至干。加人200 ;xL甲苯，在渦漩式混合器上充分混勻，待氣質聯用儀進樣。同時用克倫特 羅標準使用液做系列同步衍生。

　　5,4氣相色譜-質譜法測定

　　5.4. 1氣相色譜-質譜法測定參數設定

　　氣相色譜柱:DIV5MS 柱，30 m X 0• 25 mmXO. 25 pma 載氣:He,柱前psU 進樣口溫度：240flC。

　　進樣量HU不分流.

　　柱溫程序：70t：保持1 min，以18t：/min速度升至200X：，以StVniin的速度再升至245T：,再以 25T：/min 升至 280X：并保持 2 min。

　　EI源

　　電子轟擊能：70 eV。 •

　　離子源溫度：200t：。

　　接口溫度：2851。

　　溶劑延遲：12 min。

　　£1源檢測特征質譜峰:克倫特羅：11^86、187、243、262;美托洛爾：11^72、223。

　　5.4,2測定

　　吸取1 衍生的試樣液或標準液注人氣質聯用儀中，以試樣峰(m/2 86,187,243,262,264,277,

　　333)與內標峰(m/z 72,223)的相對保留時間定性，要求試樣峰中至少冇3對選擇離子相對強度(與基峰 的比例)不超過標準相應選擇離子相對強度平均坑的士20%或3倍標準差。以試樣峰(m/2 86)與內標 嶺(mA 72)的峰面積比單點或多點校準定量。

　　5,4.3克倫特羅標準與內標衍生后的選擇性離子的總離子流圖及質譜圖

　5.5結果計算

　　按內標法單點或多點校準計炸試樣中克倫特羅的含量。

　　見式(1):

　　6精密度

　　在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過笄術平均值的20%。

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