蛋白印跡（Western blot）實(shí)驗(yàn)

 

內(nèi)容簡(jiǎn)介

Western，也稱Western blot、Western blotting、Western印跡，是用抗體檢測(cè)蛋白的重要方法之一。如檢測(cè)材料或者藥物對(duì)某個(gè)信號(hào)通路上蛋白靶點(diǎn)的影響，檢測(cè)對(duì)細(xì)胞內(nèi)某個(gè)特定蛋白的表達(dá)量。首先通過(guò)凝膠電泳將不同分子量大小蛋白進(jìn)行分離，后續(xù)利用特異性抗體識(shí)別一定分子量大小的目的蛋白。

 

結(jié)果展示

 

上圖是通過(guò)Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白的表達(dá)情況

 

服務(wù)說(shuō)明

送樣方式：

需要您提供1.    待測(cè)樣品（材料或者樣品處理后的細(xì)胞/蛋白，也可由我們代處理）。

            2.    提供待測(cè)樣品的一抗及其說(shuō)明書(shū)（一抗一般為5ul，也可由平臺(tái)代購(gòu)）。

            3.    其他所涉及的細(xì)胞、試劑盒以及生物耗材等平臺(tái)都可以有償提供。

 

服務(wù)周期：

具體按照實(shí)驗(yàn)要求，一般為接受樣品后2-3周，具體實(shí)驗(yàn)周期請(qǐng)預(yù)約前與工作人員溝通確認(rèn)，謝謝！

 

收費(fèi)說(shuō)明：

項(xiàng)目	收費(fèi)
蛋白提取	50-100/樣
檢測(cè)費(fèi)用	800/張膜
試劑費(fèi)用	依據(jù)實(shí)際訂購(gòu)價(jià)格

 

交付內(nèi)容：

實(shí)驗(yàn)報(bào)告、內(nèi)參蛋白和目的蛋白曝光膠片各一張。

 

服務(wù)簡(jiǎn)介

Western Blot是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實(shí)驗(yàn)方法。其基本原理是通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細(xì)胞或者組織樣本中的蛋白，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉后目標(biāo)蛋白與特有性一抗結(jié)合，再與辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色，分析曝光條帶的位置和灰度分析獲知目標(biāo)蛋白在樣本中的表達(dá)情況。該法結(jié)合了凝膠電泳和固相免疫測(cè)定兩種技術(shù)的高特異性和高敏感性，可以對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行定型和半定量的分析。

蛋白分子量測(cè)定

 

內(nèi)容簡(jiǎn)介

蛋白分子量測(cè)定（2W以下的用MALDITOF/，2萬(wàn)以上的用SDS凝膠電泳）

SDS是十二烷基硫酸鈉的簡(jiǎn)稱，它是一種陰離子表面活性劑，加入到電泳系統(tǒng)中能使蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵打開(kāi)，并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上（在一定條件下，大多數(shù)蛋白質(zhì)與SDS的結(jié)合比為1.4gSDS/1g蛋白質(zhì)），使各種蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物都帶上相同密度的負(fù)電荷，其數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，從而使其電泳遷移率只取決于分子大小這一因素，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量的對(duì)數(shù)和遷移率所作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可求得未知物的分子量。

優(yōu)缺點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)成本較低，儀器設(shè)備也相對(duì)很簡(jiǎn)單，一套電泳裝置即可。但是精確程度相對(duì)較低，好的電泳圖譜需要一定的技術(shù)。 

 

基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜技術(shù)（MALDI-MS）是將待測(cè)物懸浮或溶解在一個(gè)基體中，基體與待測(cè)物形成混晶，當(dāng)基體吸收激光的能量后，均勻傳遞給待測(cè)物，使待測(cè)物瞬間氣化并離子化。基體的作用在于保護(hù)待測(cè)物不會(huì)因過(guò)強(qiáng)的激光能量導(dǎo)致化合物被破壞。MALDI的原理是用激光照射樣品與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜，基質(zhì)從激光中吸收能量傳遞給生物分子，而電離過(guò)程中將質(zhì)子轉(zhuǎn)移到生物分子或從生物分子得到質(zhì)子，而使生物分子電離的過(guò)程。TOF的原理是離子在電場(chǎng)作用下加速飛過(guò)飛行管道，根據(jù)到達(dá)檢測(cè)器的飛行時(shí)間不同而被檢測(cè)即測(cè)定離子的質(zhì)荷比（M/Z）與離子的飛行時(shí)間成正比，檢測(cè)離子。

優(yōu)缺點(diǎn)：（1）同ESI-MS 一樣對(duì)樣品的消耗很少；（2）隨著質(zhì)量分析器的不斷改進(jìn)、新的基質(zhì)的不斷發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用以及延遲萃取技術(shù)的使用，使得MALDI-MS 的最高分辨率不斷提高，甚至超過(guò)ESI-MS；（3）MALDI-MS 單電荷峰占主要部分，碎片峰少，非常有利于對(duì)復(fù)雜混合物的分析，且能忍受較高濃度的鹽、緩沖劑和其他難揮發(fā)成分，降低了對(duì)樣品預(yù)處理的要求；（4）MALDI-TOF 質(zhì)譜對(duì)生物大分子分子量的測(cè)定范圍是所有測(cè)試技術(shù)中最廣的。

 

 

服務(wù)說(shuō)明

需要您提供：

1. 蛋白大概分子量信息。

2. SDS-page需要使用的marker信息。

測(cè)試周期：收到樣品1周左右時(shí)間出數(shù)據(jù).

測(cè)試設(shè)備：凝膠電泳儀，MALDI-TOF 質(zhì)譜儀

 

酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)測(cè)試

內(nèi)容簡(jiǎn)介

ELISA介紹

ELISA實(shí)驗(yàn)是采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測(cè)物與酶連接，然后通過(guò)酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測(cè)定。測(cè)定的對(duì)象可以是抗體也可以是抗原。

在這種測(cè)定方法中有3種必要的試劑：1.固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）2.酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物）3.酶作用的底物（顯色劑）

測(cè)量時(shí)，抗原（抗體）先結(jié)合在固相載體上，但仍保留其免疫活性，然后加一種抗體（抗原）與酶結(jié)合成的偶聯(lián)物（標(biāo)記物），此偶聯(lián)物仍保留其原免疫活性與酶活性，當(dāng)偶聯(lián)物與固相載體上的抗原（抗體）反應(yīng)結(jié)合后，再加上酶的相應(yīng)底物，即起催化水解或氧化還原反應(yīng)而呈顏色。

其所生成的顏色深淺與欲測(cè)的抗原（抗體）含量成正比。用分光光度計(jì)（酶標(biāo)儀）加以測(cè)定。其方法簡(jiǎn)單，方便迅速，特異性強(qiáng)。

 

測(cè)試過(guò)程（以試劑盒為例）

1.    加樣：分別設(shè)空白孔(空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同)、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50μl，待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測(cè)樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。

2.    溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育30分鐘。

3.    配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備。

4.    洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。

5.    加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。

6.    顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10 分鐘。

7.    終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。

8.    測(cè)定：以空白孔調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度(OD值)。測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

 

結(jié)果展示

提供：原始數(shù)據(jù)；簡(jiǎn)單數(shù)據(jù)處理和繪圖；

 

服務(wù)說(shuō)明

樣品準(zhǔn)備要求：

1.所檢測(cè)蛋白測(cè)試的試劑盒（也可以由公司代購(gòu)）；

2.所檢測(cè)的樣品；

 

服務(wù)簡(jiǎn)介

ELISA檢測(cè)是免疫檢測(cè)中的一項(xiàng)重要技術(shù)，該法具有靈敏、特異、簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定及可自動(dòng)化操作等特點(diǎn)。目前已廣泛應(yīng)用于臨床檢測(cè)及研究領(lǐng)域。本法不僅可以用來(lái)測(cè)定抗體，而且也可用于測(cè)定體液中的抗原，所以也是一種早期診斷的良好方法。ELISA方法也合適用于經(jīng)mRNA表達(dá)譜芯片、蛋白芯片或蛋白質(zhì)組學(xué)（質(zhì)譜）等實(shí)驗(yàn)找出差異蛋白后，進(jìn)一步驗(yàn)證差異蛋白。

 

檢測(cè)項(xiàng)目

提供間接法ELISA檢測(cè)、夾心法ELISA測(cè)定和競(jìng)爭(zhēng)法ELISA測(cè)定，以及ELISA試劑盒訂購(gòu)，組織樣本勻漿。

間接法ELISA檢測(cè)：

用特異性抗原包被固相載體，加入待測(cè)的抗體樣品反應(yīng)后，再加入酶標(biāo)二抗，經(jīng)底物顯色后測(cè)定。

夾心法ELISA檢測(cè)：

用第一抗原或抗體包被固相載體，加入待測(cè)的抗體或抗原反應(yīng)后，再加入酶標(biāo)的第二抗原或抗體，經(jīng)底物顯色后測(cè)定，即可計(jì)算出待測(cè)抗原的量。此方法所用抗原一般為大分子抗原，如蛋白等，不適用于多肽等半抗原。

競(jìng)爭(zhēng)法ELISA檢測(cè)：

用特異性抗體包被固相載體，同時(shí)加入酶標(biāo)抗原和待測(cè)抗原的混合物樣本，待測(cè)抗原將與酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相上抗體結(jié)合。經(jīng)底物顯色后測(cè)定，計(jì)算兩組數(shù)值之差即可推出待測(cè)抗原的量。此方法常用于測(cè)定小分子抗原。

 

樣品要求

1. 客戶提供含待測(cè)樣品的標(biāo)本（血清、血漿等），我們根據(jù)客戶的需要（定性、定量）制定技術(shù)服務(wù)路線。
2. 需提供待檢測(cè)抗體和包被用抗原。
3. 檢測(cè)的樣本為細(xì)胞培養(yǎng)上清、人和動(dòng)物的血清、血漿時(shí)，樣本收集后應(yīng)立即-20度保存，若長(zhǎng)期保存應(yīng)-80度保存。
4. 樣本量的要求：若一個(gè)指標(biāo)做復(fù)孔檢測(cè)應(yīng)不少于250ul，做單孔檢測(cè)應(yīng)不少于120ul。建議若客戶樣本量充足最好提供500ul以上。
5. 客戶的樣本收集后，立即按要求保存，切忌反復(fù)凍融。外地客戶郵寄需要用干冰運(yùn)輸，郵寄前請(qǐng)與技術(shù)支持溝通確認(rèn)。